更新时间：2023-02-17 12:22
在体内自然状态下，二硫键与巯基的相互转化主要是通过巯基/二硫键氧化还原酶的催化而实现的 。天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤，在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。在体外人工环境下，从氨基酸水平来看，半胱氨酸在碱性溶液中易被氧化形成二硫键，生成胱氨酸。氧化和还原剂均可打开二硫键。在研究蛋白质结构时，氧化剂过甲酸可定量拆开二硫键，生成相应磺酸。还原剂如巯基乙醇 、巯基乙酸也能拆开二硫键，生成相应巯基化合物。由于半胱氨酸中巯基很不稳定，极易氧化，因此利用还原剂拆开二硫键时，往往进一步用碘乙酰胺、氯化苄、N-乙基丁烯二亚酰胺和对氯汞苯甲酸等试剂与巯基作用，将其保护起来，防止其重新氧化。
1、RP-HPLC法测定巯基含量
采用色谱柱Kromasil-C18 (250×4.6mm，5μm)，流动相A（0.1%TFA）和流动相B（甲醇）梯度洗脱：流动相B 40%~80%，0~10min，然后80% B保持5min，流速0.8mL/min，检测波长327nm，得到NTB标准曲线y=3.67059x+0.14123，回收率101.9%，RSD=1.17%，从而建立了一种高灵敏度巯基检测方法。
2、采用分子荧光光谱法作为反应条件，用反相高效液相色谱梯度洗脱法测定巯基
用OPA、丹酰氯、茚三酮与半胱氨酸反应，测其可见紫外吸收光谱及荧光光谱；在不同pH、温度、反应时间条件下，用OPA与半胱氨酸反应测其荧光度；分别吸收0.1mmol/L半胱氨酸溶液0、20、40、60、80、100 μL，各加入10 μL H2O2，室温下反应30min，然后加热蒸干，残渣用200μL OPA衍生液，定容至5mL，4 min时测其荧光光谱。取pH=8.4的硼酸缓冲溶液5μL，混合10次；加入OPA衍生液2μL，混合进样走HPLC。梯度条件：洗脱液B所占比例0min为0，17min线性增加至60%，17.5min线性增加至100%，20min洗脱结束。激发波长为340nm，荧光检测波长为450nm。
3、柱前衍生高效液相色谱-紫外检测法
以三(2-羧乙基)膦为还原剂，SBD-F为衍生剂，N-乙酰半胱氨酸为内标，C8色谱柱分离，流动相为甲醇 -磷酸盐缓冲液（pH =3.0），梯度洗脱，385nm处检测。线性范围为8.3～1042.6 μmol/L，最低检测限为 0.42μmol/L，日间精密度为1.67%～1.86%，日间精密度为 2.08%～3.06 %，平均回收率为98.1%～103.2%。
4.、电化学脱附与荧光技术联用
将样品固定在烷基硫醇自组装膜修饰的金电极表面，通过荧光试剂马来酰亚胺与游离巯基反应原位标记GSH，恒电位条件下脱附电极表面吸附物，检测脱附物在0.1 mol·L KOH溶液中的荧光强度。
5、拉曼光谱法
对于巯基在拉曼光谱方面研究主要集中在含巯基的芳香族化合物上，巯基与银反应生成牢固的-SAg键，失去了原有的特征性巯基氢键，其光谱特点发生明显改变。